**沉淀原理：
**沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及**蛋白質(zhì)如“proteinA”特異性地結(jié)合到**球蛋白的FC片段的現(xiàn)象而開發(fā)出來的分離抗原的**學(xué)方法。目前多用的“proteinA”等預(yù)先結(jié)合固化在Agarosebeads上，使之與含有抗原的溶液幾抗體反應(yīng)后，beads上的proteinA就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。（如圖1）

二、**沉淀實驗方案（供實驗者參考）：
（一）實驗材料
試劑及緩沖液：①細(xì)胞裂解產(chǎn)物（樣品）；②ProteinGorProteinAslurry；③一抗；④細(xì)胞裂解緩沖液；⑤PBS；⑥SDS-PAGEsamplebuffer；⑦蛋白酶抑制劑
設(shè)備：①離心機(jī)；②搖床或rotator

（二）實驗方法：
A)樣品（細(xì)胞裂解物）準(zhǔn)備
1.收集約107細(xì)胞。
（注：1ml體積中所含細(xì)胞總數(shù)和合適的凝膠上樣量取決于不同蛋白以及其抗體的特性）
2.加入約10ml的PBS到錐形管中，并用400×g離心10分鐘洗滌細(xì)胞。
3.棄去上清液并重復(fù)第2步洗滌細(xì)胞。
（注：對于細(xì)胞培養(yǎng)皿中的單層貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液后，用PBS洗滌兩次，盡量避免破壞細(xì)胞層）
4.完全棄去上清液后，加入1ml預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑（ProteaseinhibitorCocktail）的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞。小心地vortex混勻.
（注：為防止蛋白酶的作用，細(xì)胞裂解液應(yīng)當(dāng)預(yù)冷。所有接下來的操作都在低溫條件下進(jìn)行，并且蛋白酶抑制劑預(yù)先添加到細(xì)胞裂解液中;此步驟對于細(xì)胞培養(yǎng)皿中的單層貼壁細(xì)胞，可在10cm的培養(yǎng)皿中加入1ml預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解）。
5.把錐形管或培養(yǎng)皿放在冰上孵育30分鐘，并間斷性地混勻。
6.4℃，10000×g離心細(xì)胞裂解物15分鐘。
7.小心地收集上清液轉(zhuǎn)置干凈的管中備用；此樣品可凍存于-80℃作長期保存。

B）樣品的預(yù)清洗(可選做)
1.在eppendorf管中加入50ulProteinGbeadslurry，并加入450ul預(yù)冷的細(xì)胞裂解液。10000×g離心30秒后棄去細(xì)胞裂解液;用500ul預(yù)冷的細(xì)胞裂解液重復(fù)洗滌一次，*后用50ul預(yù)冷的細(xì)胞裂解液重懸微球。
2.把洗滌好的50ulProteinGbead加入到盛有500ul細(xì)胞裂解樣品的eppendorf管中，于冰上孵育30-60分鐘。
3.4℃，10000×g離心10分鐘后把上清液轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管。若轉(zhuǎn)移過來的上清液中仍含有ProteinGbead，可以再次離心處理后小心地轉(zhuǎn)移上清到另一新的eppendorf管。

C）**沉淀
1.在盛有預(yù)清洗的細(xì)胞裂解樣品的eppendorf管中加入5-10ug相應(yīng)抗體。
（注：抗體的濃度是影響**沉淀反應(yīng)的重要因素；建議實驗者進(jìn)行預(yù)實驗摸索出合適的使用濃度）
2.4℃孵育1小時。
3.加入50ul預(yù)洗的ProteinGbeadslurry（微珠處理參考上面樣品的預(yù)清洗中**步方法）。
4.于4℃旋轉(zhuǎn)混勻孵育1小時。
5.4℃，10000×g離心eppendorf管30秒。
6.小心并盡量完全地移除上清液后用500ul的細(xì)胞裂解液洗滌微珠3-5次；為減少非特異背景影響，每次洗滌都要盡量小心并完全地移除上清液。
7.*后一次洗滌并棄去上清液后加入50ul的Laemmlisamplebuffer工作液。旋渦混勻后加熱至90-100℃十分鐘。
8.10000×g離心5分鐘，收集上清液。取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時不用的樣品可以-20℃保存。
9.按照電泳說明進(jìn)行SDS-PAGE電泳。染膠分析沉淀蛋白。
（注：如果接下來用于**印跡（WB）分析，則按相應(yīng)的WB操作步驟繼續(xù)實驗。推薦用eBioscience的TrueBlotTM可以得到更佳WB的效果；WB的抗體使用濃度和**沉淀的濃度不同，需視具體情況而定，這里建議應(yīng)用不同克隆號的抗體。）

三、附錄：
（1）緩沖液的制備參考
NP-40CellLysisBuffer:
50mMTris-HclpH8.0
150mMNacl
1%NP-40
ProteaseinhibitorCocktail:
PMSF,5mg(50ug/ml)
Aprotinin,100ug(1ug/ml)
Leupeptin,100ug(1ug/ml)
Pepstatin,100ug(1ug/ml)
100%Ethanolbringupto1ml,aliquot

（2）**沉淀（IP）的常見問題及解答

1.用于一般免染的抗體是否都可以用作**沉淀實驗？
答：抗體的性質(zhì)對**沉淀實驗影響很大。抗體不同，和抗原以及ProteinG或ProteinA的結(jié)合能力也就不同。所以一般免染能結(jié)合的抗體未必能用于IP反應(yīng)。
一般來說，多抗是沉淀反應(yīng)*好的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于**沉淀。

2.為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？
答：從活性細(xì)胞裂解出來的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預(yù)檢測蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進(jìn)行實驗。

3.溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？
答：多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合。

4.**沉淀實驗應(yīng)如何把握抗體和緩沖液的比例？
答：每次沉淀實驗之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5.**沉淀應(yīng)該如何配制細(xì)胞裂解液？
答：適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC(sodiumde-oxycholate)，SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。所以裂解液的配制時所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實驗者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。